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北理工在原核生物基因組編輯技術的優化及應用方面取得重要研究成果


  近日,北京理工大學生命學院霍毅欣課題組在原核生物CRISPR基因組編輯技術的優化及應用方面再次取得重要研究成果黑龙江福彩p62走势图,并發表于TOP(頂級)期刊《Applied Microbiology and Biotechnology》。論文的第一作者為2019級博士生黃潮勇,通訊作者為霍毅欣教授,天工所張學禮和畢昌浩研究員、北理工馬曉焉特別副研究員參與了這項研究黑龙江福彩p62走势图。該研究的部分工作在北理工—洛加大蘇州研究院聯合實驗室完成,項目獲得國家自然基金委面上項目、科技部重點研發項目、北京理工大學科技創新項目黑龙江福彩p62走势图、以及蘇州工業園區的資助。該課題組不久前剛在Q1期刊《Microbial Cell Factories》上發表相關領域研究成果,論文的第一作者為2019屆碩士畢業生張姣,通訊作者為霍毅欣教授;植生所蔣宇研究員參與了這項研究黑龙江福彩p62走势图。

  CRISPR/Cas9作為新一代基因組編輯技術,已經被廣泛應用于動物黑龙江福彩p62走势图、植物以及微生物的基因組編輯。該技術利用化膿性鏈球菌來源的Cas9蛋白(SpCas9)產生位點特異性DNA雙鏈斷裂黑龙江福彩p62走势图,再通過細胞的同源重組(HR)或非同源末端連接(NHEJ)機制修復雙鏈斷裂,同時在基因組上引入所需要的突變。與真核生物不同,原核生物普遍難以修復DNA雙鏈斷裂黑龙江福彩p62走势图,絕大多數細菌缺乏NHEJ系統,而只具有效率很低的HR系統。因此,大多數研究者選擇將CRISPR/Cas9與重組工程相結合黑龙江福彩p62走势图,通過過表達噬菌體來源的λ-Red系統(一種效率很高的HR系統)幫助原核生物修復DNA雙鏈斷裂,從而提高編輯效率。與NHEJ介導的基因組編輯相比黑龙江福彩p62走势图,HR介導的基因組編輯需要一個供體DNA作為編輯模板,這使基因組編輯操作變得復雜黑龙江福彩p62走势图。研究表明,某些原核生物具有類似真核生物的簡化版NHEJ系統,這些NHEJ系統只需要兩個功能蛋白Ku和LigD。大腸桿菌一直以來被認為缺乏NHEJ系統,近年來黑龙江福彩p62走势图,國內有研究者將結核分枝桿菌和恥垢分枝桿菌來源的NHEJ系統導入大腸桿菌,成功地開發出了一種不依賴HR的基因組編輯方法用于快速刪除大腸桿菌基因組序列黑龙江福彩p62走势图,大大加速了大腸桿菌遺傳改造的進程黑龙江福彩p62走势图。事實上,國外有研究者證明大腸桿菌具有一個類似于NHEJ的末端連接系統(研究者將其命名為A-EJ),該系統的功能蛋白不是Ku和LigD,而是RecBCD和LigA。由于A-EJ修復DNA雙鏈斷裂的效率遠低于NHEJ,目前還沒有利用A-EJ進行基因組編輯的報道黑龙江福彩p62走势图。是否有可能用A-EJ代替NHEJ進行基因組編輯呢?答案是肯定的。

圖1 基于CNEE的基因組編輯流程

  北京理工大學生命學院的霍毅欣教授課題組利用David Liu課題組開發的 xCas9-3.7(SpCas9的進化版突變體)和Jennifer Doudna課題組改造的sgRNA(tracrRNA : crRNA的強化版融合體)構建了一個雙質粒嚴謹誘導型的基因組編輯系統,并將其命名為CNEE。該系統極為簡單,其功能組件只有Cas9和sgRNA,沒有任何外源的DNA修復蛋白,利用該系統黑龙江福彩p62走势图,即使宿主的DNA修復系統效率極低,也能高效率地進行基因組編輯。該課題組將CNEE系統導入大腸桿菌,在宿主A-EJ系統的協助下黑龙江福彩p62走势图,實現了高效的基因敲除和長達83 kb的大片段刪除(圖1)。這種方法不需要編輯模板黑龙江福彩p62走势图黑龙江福彩p62走势图,可以實現快速迭代的大腸桿菌遺傳改造,并且編輯效率不依賴于高轉化活性的宿主細胞。由于RecBCD和LigA(或它們的同源基因)在所有的原核生物中都存在,因此理論上CNEE系統適用于任何原核生物的基因組編輯黑龙江福彩p62走势图。隨后黑龙江福彩p62走势图,該課題組在CNEE的基礎上構建了一個變異系統,為了方便描述,暫且把該系統稱為CNEE-V1黑龙江福彩p62走势图。將CNEE-V1導入大腸桿菌,可以在宿主RecA同源重組系統的協助下實現高效精確的基因組編輯黑龙江福彩p62走势图黑龙江福彩p62走势图,包括序列的刪除、插入和替換。CNEE-V1是對CNEE的有效補充黑龙江福彩p62走势图;由于RecA(或它的同源基因)在所有的原核生物中都存在,因此理論上CNEE-V1也適用于任何原核生物的基因組編輯。此外黑龙江福彩p62走势图,該課題組還證明,將分枝桿菌來源的NHEJ系統引入CNEE可以進一步增強CNEE的性能;同樣,將噬菌體來源的λ-Red系統可以進一步增強CNEE-V1的性能。相關成果發表于TOP(頂級)期刊《Applied Microbiology and Biotechnology》,原文鏈接:https://doi.org/10.1007/s00253-019-10104-w

圖2 谷氨酸棒桿菌遺傳改造提高異丁酸產量

  CRISPR/Cpf1是繼CRISPR/Cas9之后被開發出來的基因組編輯系統。與CRISPR/Cas9相比黑龙江福彩p62走势图,CRISPR/Cpf1脫靶率更低且所需的核酸酶和RNA分子更小,因此在基因組編輯領域具有巨大的應用潛力。然而黑龙江福彩p62走势图,編輯效率相對較低限制了CRISPR/Cpf1基因編輯系統的應用。谷氨酸棒桿菌是一種重要的工業生產菌株黑龙江福彩p62走势图,此前,研究者利用CRISPR/Cpf1在谷氨酸棒桿菌中進行基因組編輯的效率低于15%,且無法利用線性DNA作為修復模板。因此,該課題組針對谷氨酸棒桿菌的基因組編輯對CRISPR/Cpf1系統進行了系統的優化,優化參數包括PAM序列黑龙江福彩p62走势图、間隔序列的長度、修復模板的類型黑龙江福彩p62走势图。利用優化后的CRISPR/Cpf1系統在谷氨酸棒桿菌中進行基因組編輯的效率顯著提高,且可以利用線性DNA作為修復模板。隨后,該課題組利用優化后的CRISPR/Cpf1系統對野生型谷氨酸棒桿菌進行遺傳改造,通過敲除基因 pyc 、 ldh 和 adhA 成功地提高了異丁酸的產量(圖2)。相關成果發表于《Microbial Cell Factories》,原文鏈接:https://doi.org/10.1186/s12934-019-1109-x

 

 

附霍毅欣簡介:

  霍毅欣教授本科畢業于南開大學,獲北京大學和巴黎七大雙博士學位,曾經在法國巴斯德研究所、美國加州大學洛杉磯分校等歐美科研院校和生物公司學習和工作十三年,兼有在學術界從事基礎研究和工業界開展應用轉化研究的經歷。2016年起在北京理工大學組建代謝工程課題組,圍繞著“天然資源的微生物精煉與制造”,以“人工細胞工廠的設計-構建-篩選-放大”為主線黑龙江福彩p62走势图,以多種模式生物為研究對象,開展了一系列研究黑龙江福彩p62走势图,取得了多項研究成果。自2018年以來以通訊作者或第一作者身份在頂級期刊Nature Communications(1篇)、Metabolic Engineering(1篇)、Applied Microbiology and Biotechnology(4篇)、Current Opinion in Biotechnology(1篇)及重要期刊ACS Synthetic Biology(1篇)、Microbial Cell Factories(2篇)、Engineering(1篇)、Journal of Biotechnology (1篇)、JoVE(1篇)上發表論文,申請多項發明專利黑龙江福彩p62走势图。

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